（知识点）细菌的革兰染色法的实际应用意义

一、细菌的革兰染色法

革兰染色法(Gramstain)是真菌学上最精典的、使用最广泛的一种染色方式.由法国真菌学家革兰(Gram)于1883年成立.真菌染色后,除了可以观察其形态,并且可依照染色结果将真菌分为两大类,即革兰阴性菌(G+菌)和革兰阳性菌(G-菌).

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1、原理：

(1)G+菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚),且脂类浓度少,丙酮不易溶入脱色；G-菌细胞壁结构疏松(肽聚糖层薄),且脂类浓度多,丙酮溶化脂类后易溶入细胞而脱色.

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(2)G+菌菌体富含大量内质网核酸镁盐,可与碘、结晶紫牢靠结合,使已着色的真菌不被乙酸脱色.G-菌菌体内核糖核酸镁盐浓度小,易被乙酸脱色. #

(3)G+菌等电点比G-菌低,在同一pH条件下阴性菌比阳性菌所带阴电荷要多,故与带正电荷的酸性颜料(结晶紫)结合牢靠,不易被乙酸脱色.

2、应用

革兰染色法的实际应用意义有三： #

(1)根据革兰染色法可把真菌分为G+和G-两大类； #

(2)G+菌和G-菌的致病性不同,所致疾患各异； #

(3)对G+和G-菌,选择不同抑菌物医治.

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3、材料

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(1)猕猴桃杆菌和大肠埃希菌培养18～24h后的混和菌液. #

(2)兰染色液：结晶紫碱液、碘液、95%酒精、稀释复红或沙黄碱液.

(3)载玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等. #

4、方法

标本片制备

(1)载玻片打算：取一张清洁载玻片,用蜡笔在其反面画出二个有一定间隔、直径约1～2cm的涂擦范围,用数字或符号做好标记.

(2)活检：将接种环在火焰上灼热杀菌,冷却后取菌液直接涂胶在标记的涂擦范围内.接种环在火焰上灼热杀菌.

(3)干燥：活检最好在温度下自然干燥,或将标本面向下,放在离酒精灯火焰约半尺高处平缓烘干,切不可置于火焰上烧干. #

(4)固定：将干燥后的活检用片夹捉住,使涂擦面向下平缓通过火焰3次,之后自然冷却.固定即可杀害真菌,并使病菌固着于玻片上,以免染色时开裂；又可使病菌蛋白融化,而易着色. #

革兰染色法： #

(1)初染：在固定好并冷却了的活检上滴加结晶紫碱液1～2滴,作用1min后,用细水流从玻片的一端把游离的碱液驱走. #

(2)媒染：滴加卢戈(Lugol)碘液数滴,作用1min后水洗.碘液是媒染剂,使结晶紫碱液与真菌结合更牢靠. #

(3)脱色：滴加95%酒精数滴,轻轻摇晃玻片,使玻片上流下的酒精子无白色为止(约需0.5～1min),流水冲洗. #

(4)复染：滴加稀释复红(或沙黄)碱液数滴,作用1min后流水冲洗.最后用吸水纸印干标本片或自然干燥后,玻片上滴加香柏油,用油镜观察.

5、结果 #

G+菌染成红色；G-菌染成黑色. #

6、影响诱因 #

⑴操作诱因：活检太厚或太薄,菌体分散不均匀,可影响染色结果.固定时防止菌体过分受热.脱色时间要按照活检薄厚灵活把握.

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⑵细菌诱因：不同时间培养物,革兰染色结果有差别,如猕猴桃杆菌幼龄菌染成红色.而老龄菌被染成黑色.真菌染色时最好用18～24h的真菌培养物.

⑶染液诱因：所有染色液应避免水份蒸发而影响含量,非常是卢戈碘液久存或受光作用后易丧失媒染作用.脱色酒精以95%含量为宜,若瓶密封不良或活检上积水过多,可使酒精含量升高而减小其脱色能力.

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二、细菌荚膜染色法(Hiss法) #

1、原理与应用 #

真菌荚膜是真菌细胞壁外边的一层黏液性物质.其对颜料的亲和力弱,不易着色,一般采用负染色法染色,虽然菌体和背景着色而荚膜不着色.因而在菌体周围呈一透明圈.因为荚膜含水量在90%以上,染色时通常不用热固定,以防荚膜蒴果变型.荚膜染色法用于有荚膜真菌 #

如哮喘杆菌、流感嗜血链球菌、炭疽芽胞球菌及产气荚膜梭菌的鉴别.

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2、材料 #

⑴荚膜菌液 #

⑵结晶紫酒精饱和液5ml,加分馏水95ml混和液.

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200g/L⑶硫酸铜水碱液. #

3、方法 #

将荚膜菌活检,在空气中自然干燥,不需加热固定.滴加结晶紫染色液,在火焰上微微加热,使玻片上碱液冒蒸气为止,不要水洗,再用200g/L盐酸铜水碱液冲洗碱液,切莫用流水冲洗.用吸水纸榨干后油镜观察. #

4、结果

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真菌菌体呈黄色,荚膜呈淡青色或无色. #

三、细菌疟原虫染色法

1、原理与应用 #

真菌疟原虫为真菌的运动脏器.其形态狭长,半径约10～20nm,需用电子显微镜能够观察到.若用特殊染色使疟原虫增粗并着色,则在普通光学显微镜下也可观察到.疟原虫染色方式好多,但原理基本类似,即在染色前先经媒染剂处理,使疟原虫增粗,之后再进行染色.

2、材料 #

(1)变型球菌6～8h血琼脂平板培养物.

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(2)染色液. #

A液：200g/L钾硼砂液(加温溶化)20ml,50g/L石炭酸液50ml,200g/L鞣酸液(加温溶化)20ml. #

B液：复红酒精饱和液.

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取A液9份和B液1份混和后立刻过滤.溶液放置6h后,使用最佳.

（3）分馏水管

3、方法

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(1)真菌标本制备：取变型球菌血琼脂平板培养物,仔细从菌膜伸展最远处挑取菌少许,轻轻装入分馏水管中,经数min使其自行分散,再3725℃～30min.

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(2)活检：取上述菌液一接种环,轻轻滴于载玻片上,使成薄膜.涂擦时接种环随水滴联通,切莫与玻片相磨,以免疟原虫开裂. #

(3)染色：活检自然干燥(勿用火焰固定)后,加染色液作用1～2min,水洗、吸干、镜检.

4、结果

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疟原虫呈淡黄色,菌体呈绿色.

四、细菌芽胞染色法

1、原理与应用

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芽胞具有高度的折光性,外膜致密,渗透性低,故普通染色法不易使其着色,芽胞染色法是按照芽胞既无法着色,而一旦着色又无法脱色的特征设计的.所有芽胞染色法都基于同一个原则：采用着色力强的颜料,并加热以推动标本着色,之后使菌体脱色,而芽胞上的颜料仍保留,经复染后,菌体和芽胞呈现不同的颜色.

2、材料 #

(1)白喉梭菌48～72h培养物

(2)石炭酸复红液、碱性美兰液、95%酒精

3、方法

(1)将白喉梭菌培养物活检,自然干燥,火焰固定,滴加石炭酸复红液,并加温至形成蒸气(不可煮熟)约5min,避免碱液干渴,随时补充,待载玻片冷却后,水洗. #

(2)用95%酒精脱色2min,水洗. #

(3)滴加美兰碱液复染30sec,水洗,待干,镜检.

4、结果

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芽胞呈白色,菌体呈淡蓝. #

五、抗酸染色法 #

1、原理与应用 #

结核分枝球菌对甲苯颜料通常不易着色,若加温或延长染色时间使其着色后,再用3%硫酸酒精处理也不易脱色,经此染色后,结核分枝球菌及其他分枝弧菌呈白色,而非抗酸菌和细胞杂质等呈白色.

2、材料

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(1)结核患者痰 #

(2)抗酸染色液

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(3)玻片、片夹、滤纸片、竹签、空平皿、污物盆.

3、方法

(1)取洁净的木棍沾取痰中血丝或脓性痰,在清洁无油脂玻片上涂开.涂擦区约手指盖大.用过的木棍放在空平皿内待高压杀菌. #

(2)活检自然干燥后,用片夹挟住玻片一端,通过火焰固定.

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(3)涂擦面用滤纸片盖上,之后往滤纸片上滴加石炭酸复红碱液,使滤纸片完全被碱液沾湿,持玻片在小火上加温片刻之后离开火焰,此时可看到玻片上冒出蒸汽.待蒸汽消失后再加温,这么反复3～4次,约5min,加温时随时添加碱液勿使纸片干渴.

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(4)玻片冷却后,用接种环挑去滤纸扔到脏污盆内,流水冲洗玻片. #

(5)滴加3%硫酸酒精脱色,至涂擦均匀部位基本没有蓝色再脱下为止,水洗. #

(6)滴加吕氏美乱菊液30sec,水洗.

(7)榨干、镜检.

4、溶液配制

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萋－尼(Zichl-)抗酸染色液

(1)石炭酸复红液：硷性复红4g,溶于95%酒精100ml染色培训,作成饱和碱液,再取该饱和液10ml与5%石炭酸碱液90ml混匀即成.

(2)3%硫酸酒精子. #

浓硫酸3ml加入95%酒精97ml中即成.

(3)吕()氏美蓝染色液 #

美蓝2g,溶于95%酒精100ml中,作成饱和液.再取该饱和液30ml与0.01%氢氧化钾水碱液100ml混和均匀即可. #

六、奈瑟染色法 #

1、材料 #

(1)碱液甲

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第一液：美兰1g,95%酒精30ml,冰乙酸50ml,分馏水100ml. #

第二液：结晶紫1g,95%酒精10ml,分馏水300ml.

以上第一液二份,与第二液一份混和之.

(2)碱液乙,黄叱精1或2g染色培训,热分馏水300ml,待溶化后过滤. #

2、染色法 #

(1)活检按常规法固定后,滴加奈瑟碱液甲液数滴于活检上,15～30Sec,水洗.

(2)用奈瑟碱液乙液复染10～30秒钟. #

(3)迅速用水洗,榨干、镜检. #

3、结果

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菌体呈鲜明蓝色、异染颗粒呈深紫兰色. #