诺如病毒和水源性病毒检测体系起步晚,体系还不完善

诺如病毒(,NoV)是导致全球急性肠胃炎的主要致病原,全年均可感染,主要感染儿童、老人和免疫力低下人群。诺如病毒可以食物和水源为载体引起人类患癌,又被叫做食源性病毒(Virus)和水源性病毒(Virus)。食源性病毒和水源性病毒主要通过粪-口途径传播,因其传染性强和传播速率快等特点,成为严重恐吓人民群众的健康和生命安全,甚至影响社会稳定的重大诱因。在食源性病毒和水源性病毒造成的乳品安全车祸或突发公共卫生风波中,诺如病毒抢占了重要地位。因为食品种和水源的种类繁杂,成份复杂,污染的病毒浓度低,病毒分布不均一,且富含各类抑制病毒监测的因子等诱因,致使食源性病毒和水源性病毒检查成为全球公共卫生面临的重点和难点。我国已完善了全省病毒性肠炎检测网路,具备了完整的引发呕吐病毒病相关病毒的测量技术体系。但我国构建食源性病毒和水源性病毒监测体系起步晚,体系还不健全。目前我国仅发布了乳品(硬质表面乳品、软质蔬菜、生食水果和鱼类消化腺)中诺如病毒监测的乳品安全国家标准(GB4789.42-2023),该标准是在欧共体的ISO/TS15216-2的基础上完善,并没有进行测量方式优化。

#

但是该国标也不包括脂肪、蛋白类即时乳品中和水底诺如病毒检查方式。而在欧共体的ISO/TS15216-2中也是仅有袋装水底诺如病毒的检查,缺乏大量水底诺如病毒的测量方式。并且目前大部分水源性病毒的暴发均与现场水源(地表水、地下水和自来水)有关,而为了能测量到现场水源中低含量和分布不均的病毒粒子,须要构建适合的方式来举办现场取样和提升病毒监测的灵敏度。本研究致力对已有的临床样本中诺如病毒核苷酸检查方式进行实验室评价和应用;通过构建水和乳品中诺如病毒监测方式与产生水和乳品中病毒监测方式的操作规范,为我国水源性和食源性病毒病的测量、监测和应对提供了可借鉴的标准化实验室检查技术。一、临床样本中诺如病毒监测方式的实验室评价和应用实验室评价已发表的诺如病毒GI、GII基因型多重萤光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测量方式,应用该方式对宁夏石嘴山市2012年-2023年1863份入院儿童急性肠胃炎牛粪样本进行诺如病毒监测。结果显示在1863份入院儿童牛粪样本中,诺如病毒阴性率24.25%(12.78-32.92%),诺如病毒全年感染,夏季为感染高峰期。获得306条诺如病毒VP1区基因序列,包括6个基因型:GII.3(71.24%),GII.4(23.53%),GII.2,GII.5,GII.6,和GII.13。

诺如病毒聚合酶区序列剖析显示GII.P12/GII.3、GII.Pe/GII.4和GII.P4/GII.4是主要流行基因型。二、水中诺如病毒监测方式的构建与应用以鼠诺如病毒(-1,MNV-1)作为模式病毒和过程对照病毒,结合膜吸附洗脱富集技术(viral-,)和RT-PCR,根据采集水的容积及取样方法的不同构建和评估了两种不同的水源性诺如病毒富集技巧。结果显示(1)罐装、桶装水采用阴或阳离子膜吸附法进行病毒初次浓缩,病毒滞留率分别可以达到99.92%和98.23%;无论是阴离子膜还是阳离子膜,1%Tralk乳膏洗脱疗效最佳;超滤法对洗脱液进行二次浓缩,最终将待检水样浓缩至200μL;该监测体系能在10个小时内较好地完成0.1mL-5L水底诺如病毒和肝炎病毒的浓缩和检查,但是诺如病毒和肝炎病毒的回产率分别为15.25%和6.76%。最后该方式通过了三家实验室的验证。(2)自主研制了一种适宜野外现场取样的病毒采集系统(半手动微生物采集系统)。该系统能在野外现场无外电源的条件下2个小时内完成1000L环境水的采集(水流速10L/min);仅需将过滤完水样的膜装置低热带回实验室,用Tralk乳膏洗脱病毒,再通过PEG-6000沉淀和超滤二次浓缩最终获得了1mL浓缩水样,但是Tralk洗剂对膜的MNV-1洗脱率达到70.45%。 #

(3)对上海市西城区京密沟渠饮用水进行了病毒富集,通过骁龙量测序和病毒宏基因组剖析了该饮用水的病毒谱,发觉了5个病毒科的喂奶植物病毒谱,其中一些与人类癌症相关,包括通过粪口途径传播的主要常见病毒如诺如病毒(NoVGII.17)、肠道病毒(71,EV71)、甲肝病毒(HAV)和爱知病毒(,)。本研究完善了适宜实验室的罐装、桶装水底诺如病毒富集测量方式和适宜野外现场的大量水底诺如病毒的富集和测量方式,并应用自主研制的半手动微生物采集系统对我国南京市西城区京密沟渠举办了饮用水底病毒的富集和测量。三、食品中诺如病毒监测方式的优化与评估以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合RT-PCR检查方式,优化和评估了软醋栗、碳水化合物类乳品及蛋白质、脂肪类即食乳品中诺如病毒的测量方式。(1)考察Tralk乳膏、TGBE乳膏、TPB乳膏和NaPP乳膏对软醋栗(樱桃和蓝莓)和碳水化合物类乳品(香菜和芦笋)中MNV-1的洗脱疗效,比较洗脱液的二次浓缩方式沉淀和超滤对MNV-1的浓缩疗效。评估优化后方式对不同乳品中诺如病毒的富集疗效。

#

结果表明软醋栗樱桃中TGBE药膏-沉淀组合方式的MNV-1回收疗效优于其他组合,诺如病毒监测限为103基因拷贝/10g;猕猴桃中TGBE乳膏-超滤的MNV-1回收疗效优于其他组合,诺如病毒监测限为104基因拷贝/10g;茄子中Tralk药膏-PEG沉淀的MNV-1回收疗效优于其他组合,诺如病毒监测限为103基因拷贝/10g;大蒜中Tralk乳膏-超滤的MNV-1回收疗效优于其他组合,诺如病毒监测限为104基因拷贝/10g。(2)比较了洗脱-浓缩方式和直接RNA提取法回收面包和早餐肉中MNV-1的回收疗效,结果显示后者没有监测到面包和早餐肉的MNV-1,前者成功回收到了MNV-1,而且诺如病毒的监测限低于其他种类乳品,分别为106基因拷贝/10g和104基因拷贝/10g。本研究完善了软蓝莓、碳水化合物类乳品和脂肪蛋白类即食乳品中诺如病毒的测量方式。优化和建立了我国乳品中诺如病毒监测体系。四、贝类中病毒的测量以MNV-1为模式病毒和过程对照病毒,结合RT-PCR测量方式,初步阐述了鱼类中诺如病毒两种不同测量方式的测量疗效。(1)比较蛋白酶K结合PEG沉淀和蛋白酶K结合直接RNA提取两种鱼类中诺如病毒监测疗效。 #

用蛋白酶K结合PEG沉淀得到的MNV-1回收疗效优于蛋白酶K结合直接RNA提取方式获得的MNV-1回收疗效。(2)搜集我国南京市330份海胆样本,蛋白酶K结合PEG沉淀处理鱼类消化腺和肝脏后,借助联发科量测序和病毒宏基因组剖析获得海胆中的病毒谱。本研究通过联发科量测序后共获得了条被注释病毒的基因序列,其中以植物为寄主的病毒序列占21%(/)。而在以植物为寄主的病毒序列中,被注释到喂奶植物为寄主的病毒序列占1.26%(12205/),包括20个病毒科诺如病毒检测,其中就有小RNA病毒科()的12个病毒属和杯状病毒()的诺如病毒属()和札如病毒属(),包括常见的人疾患暴发相关的EV、HAV和NoV,其中NoV的基因型包括GII.1、GII.2、GII.13、GII.14和GII.17。NoVGII.2基因序列与目前我国NoV主要流行株的多肽同源性达到100%,而GII.17与流行株的多肽同源性为98%。其实,实验室评价了已发表诺如病毒RT-PCR检查方式诺如病毒检测,通过该方式获得了2012年-2023年宁夏石嘴山市5岁以下入院儿童诺如病毒的分子流行特点。本研究自主研制了一套适宜现场水样采集的半手动微生物采集系统,完善了水和乳品中诺如病毒的回收测量方式,产生了水和乳品中诺如病毒监测方式操作规范,并结合病毒宏基因组学方式初步阐述了饮用水源和贻贝中的病毒谱。...

#