丙烯酰胺凝胶的原理及鉴定方法以及知识/知识点

2023-05-18 来源：网络作者：佚名

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一、原理

聚丙烯酰氯乳膏是由丙烯酰氯（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰氯（N聚丙烯酰胺凝胶电泳，Nˊ-de,简称Bis）,在催化剂核黄素或过硼酸铵和四苯基乙二胺的催化下，聚和而成的具备三维网状结构的胶。 #

正常状况下蛋白的迁移率取决于它所带净电势以及分子的大小和形状等诱因。而在丙烯酰氯软膏中加入阴离子除菌剂十二羟基磺酸钠(SDS)，则蛋白的迁移率主要取决于蛋白大小，与所带电势与形状无关。因而可以借助SDS-PAGE对蛋白质分子量与含量进行鉴别以及含量的测量。

二、试剂 #

1、A氨水：1.5MTris（三硝基甲苯）聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.4%SDS，pH8.8。

2、B氨水：0.5MTris.Cl，0.4%SDS，pH6.8。 #

3、5×ESB（加样缓冲液）。 #

4、染色液：0.25%的考马斯洋红R250、40%的乙醇、10%的硫醇。 #

5、脱色液：40%的乙醇、10%的硫醇。 #

6、10×-（负极缓冲液）：、甘氨酸、1%SDS。 #

7、10%过硼酸铵（APS） #

8、异戊烷 #

9、四苯基乙二胺（TEMED）

三、制胶 #

按照蛋白样品的大小制不同含量的胶，蛋白分子量小就该制高含量的胶，分子量大的蛋白就制低含量的胶，制不同长度的胶所需的浓缩胶和分离胶体积也不一样。

5%浓缩胶：

30%Acr-Bis1ml、A碱液1.5ml、无菌水3.5ml、APS75ul、TEMED10ul。

12.5%分离胶：

30%Acr-Bis5ml、B碱液3ml、无菌水3.9ml、APS150ul、TEMED10ul。

四、加样、电泳

过稍微时间等胶融化后把蛋白和所需的鉴别的蛋白和标准品蛋白（如BSA）经处理后加到加样孔中，放入电泳缓冲液拨通电源开始跑胶。 #

五、染色、脱色 #

等示踪涂料溴酚蓝跑至胶末端，关掉电源，除去浓缩胶后，将分离胶放到考马斯洋红染色液中染色40分钟，之后倒入脱色液中脱色1小时，并换脱色液2-3次。

六、蛋白大小、纯度的鉴别及含量的测试

依据（或则蛋白标准品的相对迁移率制做的标准曲线）判定蛋白大小，依据有无杂带判断蛋白的含量。按照BSA标准品条带的灰度制做标曲，并估算出目的蛋白的相应含量。

七、注意事项

1、SDS与蛋白质的结合按品质成比列（即：1.4gSDS/g蛋白质），倘若比列不当，就不能得到精确的数据。

2、用SDS-聚丙烯酰氯乳膏电泳法测量蛋白质相对分子量时，应当同时作标准曲线。不能运用此次的标准曲线作为上次用。 #

3、有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，他们在吡啶甲酸和SDS的作用下电离成亚基或多条单肽链。因而，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰氯乳膏电泳法测量的也是他们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 #

4、有的蛋白质（如：电势异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能选用该法测相对分子量。

5、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，或许是SDS不纯造成。

八、节省时间小技巧 #

正常状况下胶跑完以后要染色脱色3-4个小时以后才会看见结果，假若我们把染色液加热一下染色那样都会推动染色，或则是把染色高考马斯洋红R250加倍10-20分钟就可以。脱色的时侯我们可以不用脱色液，直接在水底浸泡10分钟才能看见结果，假若不够清楚，可以换水再煮10分钟。 #