重组腺病毒载体的实验流程图及实验步骤及流程

腺病毒包装实验

重组腺病毒载体是基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36kb长的线性双链DNA，是一种复制缺陷型腺病毒载体系统。具有以下几个明显优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部份组织；感染效率可高达100%；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；效价高，操作便捷。为此腺病毒阳性是什么意思，重组腺病毒是一种最ju有潜力的基因递送工具。 #

最chang用的腺病毒包装体系有和AdMAX两种，其共同特征是目的基因首先克隆到穿梭载体，再重组到腺病毒的大骨架上。以上两个系统均具有腺病毒初期转录复制基因E1和E3的缺陷（ΔE1，ΔE3），其中E3基因对病毒的形成并非必需。为此，腺病毒包装必需依赖抒发E1的细胞系，比如HEK-293，HEK-293A等。

一、实验流程 #

图1、腺病毒包装实验流程图

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二、实验仪器与材料 #

表1、腺病毒包装系统引物

三、实验步骤 #

1.引物建立和扩增

AdMAX系统：建立联接目的基因的引物和(delta)E1,3Cre引物并大量抽提，用于转染293A细胞。 #

系统：建立联接目的基因的引物并进行酶切线性化；线性化后转到感受态（含-1骨架引物）进行重组，涂板培养单克隆并扩增，抽提引物进行PacI酶切验证；验证正确的重组引物转化Stbl3感受态，得到高含量的重组引物并进行PacI酶切线性化，用于转染293A细胞。 #

2.腺病毒包装

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表2、腺病毒包装转染体系

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3.腺病毒搜集 #

挑取3-6个空斑不等，倒入1ml新鲜培养基中过夜，之后比较效价，使用效价最高的一个空斑进行后续实验。（注：病毒搜集前要观察病毒空斑是否产生。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地产生，可在培养液中加入低熔点琼脂糖，通常在转染后第10~21天可以在显微镜下看见小的空斑。） #

4.腺病毒扩增 #

将培养基中的病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增，至再度出现空斑，搜集细胞及上清，反复冻融三次搜集病毒（P1代），感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增并搜集病毒。

5.腺病毒纯化 #

将病毒从-80℃冰箱取出，温度水浴熔化。在4℃下，7000g离心10min，弃细胞碎片，搜集上清，0.22μm过滤抑菌即可用于细胞实验。若用于对腺病毒效价和含量要求高的植物实验，则须要采用沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法进行纯化。

6.病毒重悬和保存

弃上清，500μl重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则放在4℃保存，如需长时间储存需放在-80℃或液氮罐保存。 #

四、注意事项 #

1.腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。 #

2.操作病毒时请穿实验服，配戴口罩和手套，尽量不要裸露手掌及脚掌的皮肤。

3.操作病毒时非常当心病毒溅出。若果操作时超净工作台有bing毒污染，请立刻用70%甲醇加1%的SDS碱液擦洗干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液曝晒后统一处理。

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4.如须要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。 #

5.植物注射操作请在生物安全柜内（BL-2级别）完成。 #

6.病毒相关的废弃物须要特殊搜集，统一经低温杀菌处理。 #

7.实验完毕用洗手液清洗右手。

五、常见问题 #

1.腺病毒载体有几代，须要如何选择？ #

第一代腺病毒载体：E1/E3基因缺位的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体； #

第二代腺病毒载体：E2A/E4基因缺位的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体，形成的免疫原性较低，载体容量和安全性方面均提升，但病毒包装难度和出毒效价严重下滑，应用受限。 #

第三代腺病毒载体：第三代载体缺位了全部的或大部份腺病毒基因，仅保留了两端ITR和包装讯号。包装容量高达35kb，免疫原性极低，载体中引入核基质附着区基因用于外源基因常年抒发并降低了载体的稳定性。但第三代载体系统须要腺病毒突变体作为辅助病毒。 #

目前，第一代腺病毒载体仍是科研和临床应用最为广泛的腺病毒载体，因而更为推荐。 #

2.腺病毒的两种包装系统如何选择？

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须要依照自己实验室的经验以及需求进行选择。

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（1）系统：操作步骤相对可控，系统得到的病毒效价相对较高。系统是较常用的系统，在感受态中完成环状腺病毒基因组的重组，将重组腺病毒基因组经PacI酶切线性化后转染293A细胞。但重组腺病毒基因组的阴性率比较低，须要选购大量的克隆进行验证。 #

（2）AdMax系统：是直接将穿梭引物和骨架引物导出到包装细胞293A中，重组过程不可控，中间难以进行筛选，所以重组假阴性较高，筛选阴性结果的难度较系统高好多。但AdMax包装系统流程更简便易操作腺病毒阳性是什么意思，适宜菜鸟研究人员。

3.腺病毒纯化的目的是哪些？ #

纯化后的腺病毒可以消除缺损的病毒颗粒、细胞毒素、细胞培养基、以及细胞碎片等杂质。纯化腺病毒免疫原性较低，更适宜做植物实验。 #

4.腺病毒感染毒斑和细胞集聚如何进行分辨？

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镜下观察发觉类似病毒空斑或则细胞集聚的现象时，应继续培养1-3天，观察集聚区域是否扩散，若持续扩散通常为病毒毒斑，若集聚区域保持不变，则通常为细胞集聚现象。 #